摘要:目的观察人参皂苷Rgl对成年大鼠脑缺血后海马区神经干细胞增殖分化的影响，探讨其促进神经发生的作用。方法将60只Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯缺血组及人参皂普Rgl治疗组。用Longa线栓法制作成年大鼠大脑中动脉闭塞模型。腹腔注射5-}}脱氧尿普(BrdU)标记处于增殖状态的神经干细胞，用免疫单标及双标免疫荧光技术观察人参皂普Rgl对局灶性脑缺血后海马区BrdU免疫活性及BrdU/Tuj-1和BrdU/Vimentin双标免疫活性的影响，并计数作定量分析。结果脑缺血后海马区存在BrdU阳性细胞分布;应用人参皂普Rgl后，上述部位及周边脑区BrdU阳性细胞数及双标阳性细胞明显增多((P}0.01)。结论人参皂普Rgl能诱导海马区神经干细胞增殖、分化，提示其具有促进神经发生的作用。

关键词:脑缺血 人参皂苷 海马 干细胞 细胞增殖

1.引言

研究发现，成年哺乳动物脑缺血后，神经十细胞(NSCs)在某些特定区域如侧脑室下区(SVZ)和海马齿状回颗粒下层(SGZ)的增殖能力有一定程度的提高，并A能分化为一定数量的神经元，但增殖分化的细胞远不能替代脑缺血后造成的大量神经元脱失，因此脑缺血成为人类致死、致残的卞要疾病之一[‘}。人参皂茸Rgl是人参的卞要活性成分之一，对神经保护、增强记忆和抗衰老作用的研究已取得了一定进展。但对脑缺血后神经发生的影响研究较少。本研究利用成年大鼠脑缺血模型，观察人参皂茸Rgl对缺血后大鼠脑内海马区NSCs增殖与分化的影响，探讨其对神经促进发生的作用，为临床应用人参皂茸防治缺血性脑血竹疾病提理论依据。

2.材料与方法

2.1动物分组及模型制作健康成年Wistar大鼠60只，雌雄不拘，由陇和医科大学遗传所提供，合格证号:SCXK(京))2002-0006。分设假手术组、单纯缺血(缺血)组和人参皂茸Rgl治疗(治疗)组。每组20只。根据Longa线栓法制作大鼠右侧局灶性脑缺血模型。术中常规检测肛温，保持在(37.0士0.5)0C。大鼠术毕清醒后，观察其行为变化，按Longa评分标准将大鼠的行为变化分为5级。将1, 2, 3级定为模型成功大鼠，0, 4级弃去。假手术组:只插线10 mm，不行其他条件十预。将各组大鼠又分为缺血后1, 3, 7, 14天4个时间点。每个时间点5只大鼠。治疗组术前5天腹腔注射人参皂茸Rgl(20mg/kg) > 2次//d o假手术组注射相同剂量的生理款水。

2.2主要试剂

人参皂茸Rgl由内蒙占康源药业有限公司提供(批号:ZZ-5802一内卫药准字(1999)1787号，规格:350mg/lOml);一抗为鼠BrdU单克隆抗体及抗兔Tuj-1, Vimentin多克隆抗体;SABC试剂盒、FITC羊抗兔IgG及TRITC兔抗羊IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。2.3 BrdU标记的增殖细胞用胸腺哈陡脱氧核有类似物BrdU标记处于增殖状态的NSCs。采用脉冲标记，各实验组大uw从处死前24 h开始，腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，每3h 1次，共4次，末次注射后10h处死大鼠。

2.4免疫组织化学及免疫荧光染色大鼠在麻醉后开胸，经升卞动脉插竹，先用生理欲水150 ml快速冲洗，继而灌注4%多聚甲醛250 ml}灌注完毕后取脑，在40C下将脑移入4%多聚甲醛固定6h，然后移入30%蔗糖液中直到沉底。行冠状切面冷冻切片，片厚15}tno

2.4.1单标免疫组织化学BrdU检测首先需要进行DNA变性。切片入50%甲酞胺/2XSSC} 650C温箱2 h} 2 mol/L HCl 370C30min，使DNA变性。经0.01 mol/L的TBS漂洗后加入鼠单克隆抗BrdU抗体，40C过夜。采用SABC法染色，切片置入葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺溶液显色，光镜下胞核呈紫蓝色为阳性结果。

2.4.2双标免疫荧光染色切片经冷内酮固定2030 min， 50%甲酞胺/2XSSC} 650C温箱2 h} 2mo1/L HCl 370C30min， 1%BSA(含0.3%Tri-tonX-100的0.01 mol/L TBS配制)，370C30 min，行双标免疫荧光标记，切片分别加兔抗Tuj-1, Vimentin抗体40C孵育过夜，FITC标记IgG(1:100)370C孵育30 min后，再加一抗鼠单克隆抗BrdU抗体(1:200)4 0C孵育过夜，然后加TRITC标记IgG(1:100)370C孵育30 min，日一油缓冲液封固。用Radi-ance 2100TM型激光共聚焦扫描显微镜观察。

2.5图像分析

免疫组织化学BrdU的阳性表达分别为各自染色条件下结构完整、定位明确、着色较深的细胞及细胞核。切片在(X 200)镜下，随机选取10个视野，采用C8真彩图象分析系统(北京航空航天大学生产)对BrdU平均阳性细胞数进行测量分析计数。荧光双标在每张切片梗死侧截取10个(X 400)视野，计数平均双标阳性细胞((BrdU+/Tuj-1+或BrdU+/Vimentin+)数。

2.6统计学方法采用SPSS 12.0软件分析。数据计算用Cx士s)表示，两两比较用t检验，P}0.05为差异有显著性意义。

3.结果

3.1 BrdU在脑组织的表达BrdU阳性细胞着色部位为胞核，成卵圆或椭圆形。免疫组织化学染色显示，假乎术组见极少BrdU表达，卞要分布于SGZ及SVZ等部位。缺血组BrdU阳性细胞数日明显增加，在脐眠体、海马CA1区、皮质及缺血梗死区周围等处均有分布。给予人参皂有Rg 1后，BrdU阳性细胞增多，缺血7天后阳性细胞达高峰，以SGZ处最为明显。在脐眠体呈簇状分布，而缺血中心区及缺血边缘区呈散落分布。缺血14天可见BrdU阳性细胞数日急剧减少，细胞质可有少量表达(表1)

3.2免疫荧光双标染色激光共聚焦扫描显微镜观察发现假乎术组未见双标阳性细胞。脑缺血14天，双标细胞卞要位于SGZ区和脐眠体内;双标细胞核中心红色为BrdU阳性，周边呈黄色为Tuj-1或Vimentin阳性。BrdU/Vimentin双标细胞胞核红色深染，圆形饱满，突起呈黄色，单个或多个突起不等;BrdU/NSE双标细胞胞核中心深红色为BrdU阳性，胞体及突起呈黄色为Tuj-1阳性(图A^-F)。治疗组BrdU/Tuj-1, BrdU/Vimentin阳性细胞数分别为(14.3士0.5)个/视野和X15.1士0.5}个/视野，较缺血组(7.2士0.3)个/视野和(8.9士0.4)个/视野明显增多((P}0.01)

4.讨论

免疫组织化学检测的BrdU阳性细胞可代表增殖的神经十细胞[z]。有证据显示[3,4]，在成年哺乳动物，SGZ存在NSCs，即在上述部位存在神经发生现象，并目能从SVZ向嗅球迁移。本研究发现，缺血后早期阶段，SGZ即有BrdU「日性细胞表达，缺血7天表达最为明显，除海马结构区外，在缺血侧大脑半球许多区域都出现了BrdU阳性细胞表达。在CA1区及皮质也有少量表达，说明脑缺血后发生了NSCs的迁移，分化成神经细胞。脑缺血损伤后，nestin, BrdU的重新表达可能有增强细胞抗损伤能力、促进损伤灶修复的作用，A能增强脑组织的抗缺血能力，有利于细胞的存活及缺血损伤后的神经再生f51

虽然脑缺血可以引起NSCs增殖，但是这种内源性的反应远不能替代脑卒中等破坏性较大的创伤所造成的神经元或胶质细胞的脱失。因此，损伤大脑尚不能达到自我修复的程度。近年的研究发现，NSCs的增殖除受细胞内基因的调控外也可受外源性因素的调节，如生长因了}I!神经递质等。有研究结果显示，碱性成纤维细胞生长因了、表皮生长因了、抗炎药物等可能具有促进脑缺血后神经前体细胞增殖的作用}}.}sl。如果我们能够认识和控制缺血后神经前体细胞增殖、成熟、迁移并与i1 :'常细胞功能性相结合这一复杂过程，则对于临床治疗脑缺血损伤及变性疾病均有重要意义[U

本实验结果发现人参皂有Rgl能促进脑内缺血区BrdU的表达。从缺血刺激大约1天后BrdU阳性细胞开始明显增多，于缺血后7天最为活跃，至14天时N义增殖己明显减弱。从。与假乎术组同一部位比较，各时间点BrdU阳性细胞数明显增多，组间比较有显著性差异。实验结果提示，人参皂苷有Rgl对脑缺血后BrdU表达有增强作用，能促进NSCs的增殖，同时阳性细胞表达范围增多，说明也能促进NSCs的迁移[10}。这在神经可塑性和脑损伤后的修复中可能起着重要作用。本研究双标免疫荧光染色结果显示，局灶性脑缺血后14天，缺血侧出现BrdU/Tuj-1, BrdU/Vimentin双标阳性细胞，治疗组双标阳性细胞数量明显增多，提示人参皂有Rgl能够促进增殖细胞分化为神经元和星形胶质细胞。上述结果表明人参皂有Rgl对成年大鼠脑缺血SGZ神经十细胞有促进增殖、迁移及分化的作用。但NSCs增殖、迁移及分化的信号转导机制等有待于进一步研究。